定量CAR-T和TCR-T產(chǎn)品中載體拷貝數(shù)的ddPCR方法

基因改造T細(xì)胞療法在癌癥免疫治療中展現(xiàn)出巨大潛力。這些T細(xì)胞產(chǎn)品通常通過能夠整合到T細(xì)胞基因組的載體進(jìn)行改造，但這也引發(fā)了對插入突變潛在風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。因此，評估整合載體拷貝數(shù)（VCN）作為基因改造細(xì)胞產(chǎn)品的關(guān)鍵安全性參數(shù)變得至關(guān)重要。這里，基于微滴數(shù)字PCR（ddPCR）方法，開發(fā)了一種穩(wěn)健的檢測方法，用于評估CAR-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞產(chǎn)品的VCN。為了準(zhǔn)確反映基因改造細(xì)胞中的VCN，根據(jù)泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)理論引入了假定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的計(jì)算。調(diào)整后的VCN值（VCNadj）還與分選的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞群體中的VCN值進(jìn)行了比較，以驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。該檢測方法能夠一致且精確地確定細(xì)胞產(chǎn)品的平均VCN。通過比較分選的轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞群體中的VCN，驗(yàn)證了改進(jìn)計(jì)算方法能更接近實(shí)際轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的VCN，從而為基因改造細(xì)胞產(chǎn)品提供更真實(shí)的VCN表示。綜上，這里提出了一種可靠且穩(wěn)健的基于ddPCR的檢測方法，用于量化基因改造細(xì)胞產(chǎn)品中的VCN。

基因改造的T細(xì)胞療法因其的療效和持久的臨床反應(yīng)而備受關(guān)注。CAR-T細(xì)胞被改造后可在細(xì)胞表面表達(dá)合成的CAR受體，使T細(xì)胞能夠識別并清除表達(dá)靶標(biāo)表面抗原的癌細(xì)胞。相比之下，TCR改造的T細(xì)胞則利用天然或稍加修飾的TCR來識別腫瘤細(xì)胞表面MHC分子上呈現(xiàn)的腫瘤特異性表位。

病毒載體，通常是復(fù)制缺陷型γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體，用作引入編碼CAR分子或TCR分子的轉(zhuǎn)基因的載體。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中。細(xì)胞基因組中整合的轉(zhuǎn)基因數(shù)量與CAR-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的療效呈正相關(guān)。然而，整合轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)增加（即載體拷貝數(shù)，VCN）同時(shí)也伴隨著更高的非受控整合風(fēng)險(xiǎn)，可能通過干擾鄰近宿主基因轉(zhuǎn)錄而引發(fā)插入突變。盡管接受基因改造細(xì)胞療法的患者曾報(bào)告出現(xiàn)繼發(fā)性惡性腫瘤，但繼發(fā)性惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)被認(rèn)為較低，并且與接受標(biāo)準(zhǔn)治療的患者相比沒有差異。具有更高VCN的產(chǎn)品可能會(huì)增加遺傳毒性，因此，仔細(xì)監(jiān)測整合的VCN至關(guān)重要，以確定能夠在保證理想臨床療效的同時(shí)小化病毒載體遺傳毒性和致癌潛力的VCN水平，這也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)在藥物產(chǎn)品放行前的要求。

傳統(tǒng)上，使用qPCR來測量VCN。該方法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行量化，精度有限。為了在臨床治療后測量VCN和監(jiān)測CAR-T細(xì)胞，開發(fā)了基于ddPCR的方法，該方法可直接量化目標(biāo)的數(shù)量。基于ddPCR的方法提高了分辨率、精確度和重復(fù)性。然而，大多數(shù)已建立的檢測方法檢查并報(bào)告的是整體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的VCN，盡管其中只有部分細(xì)胞（20%-70%）是被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，這導(dǎo)致對實(shí)際被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VCN產(chǎn)生低估。

這里，我們報(bào)告了一種用于精確測量CAR-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞產(chǎn)品中VCN的ddPCR檢測方法的開發(fā)。此外，實(shí)施了一個(gè)簡單的優(yōu)化步驟，以更準(zhǔn)確地反映轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VCN。結(jié)果顯示，該檢測方法保持了高度的特異性、精確性和可重復(fù)性，使其成為推動(dòng)工程T細(xì)胞療法研究與開發(fā)的有價(jià)值工具。

方法

1、人外周血單核細(xì)胞分離

2、基因工程改造的CAR-T和TCR-T細(xì)胞生產(chǎn)

CAR-T細(xì)胞在CliniMACS Prodigy上通過13天的生產(chǎn)流程制備。冷凍的PBMCs解凍后進(jìn)行洗滌，并用TransACT激活48h。隨后，細(xì)胞被γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，該載體編碼CAR20（靶向CD20）或CARIL13R（靶向IL13Ra2），MOI為5。這兩種CAR均包含4-1BB（CD137）和CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域。

TCR基因修飾的CD8 T細(xì)胞通過10天的生產(chǎn)工藝在CliniMACS Prodigy上制備。從冷凍保存的血細(xì)胞分離產(chǎn)物中，通過CD4和CD8磁珠的陽性選擇富集T細(xì)胞（CD4/CD8磁珠比例為1:20），用TransACT激活48h，并用攜帶嵌合TdT TCR編碼序列的γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以MOI=4進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。

收獲后，CAR-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞均進(jìn)行了冷凍保存。細(xì)胞產(chǎn)品分析VCN。

3、基因組DNA提取與定量

4、PCR引物和探針的設(shè)計(jì)

ddPCR反應(yīng)被設(shè)定為雙重檢測，以同時(shí)定量插入的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體拷貝數(shù)和人參考基因端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的拷貝數(shù)。

為了定量逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的插入，設(shè)計(jì)了一對引物和探針，專門針對WPRE，該元件通常存在于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體中，位于轉(zhuǎn)基因的3'-非翻譯區(qū)。因此，WPRE可以用作檢測插入載體的替代標(biāo)志物，并可應(yīng)用于不同的產(chǎn)品。擴(kuò)增片段已被確認(rèn)不含有EcoRI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。這對WPRE引物和探針作為定制檢測項(xiàng)目從Bio-Rad訂購，其中探針由FAM熒光染料標(biāo)記。針對參考基因TERT的引物對和探針由Bio-Rad預(yù)設(shè)計(jì)（dHsaCP2500351），其中TERT的探針由HEX熒光染料標(biāo)記。

退火溫度經(jīng)過優(yōu)化以確保檢測的佳性能。CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品用作陽性對照，而非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞作為陰性對照。ddPCR反應(yīng)在50°C-65°C的退火溫度梯度下進(jìn)行，分為8個(gè)區(qū)間。根據(jù)FAM和HEX通道中陰陽性液滴的分離情況，將佳退火溫度確定為58°C，并在后續(xù)的ddPCR實(shí)驗(yàn)中使用。

5、ddPCR

遵循Bio-Rad對ddPCR的一般指南。對于每20mL的ddPCR反應(yīng)，將不含dUTP的探針Supermix與50ng基因組DNA或5μL質(zhì)粒DNA、每種引物900nM、探針250nM以及5U EcoRI限制性內(nèi)切酶混合。反應(yīng)混合物在室溫（20-25°C）下孵育5min，然后根據(jù)制造商的說明使用QX200手動(dòng)液滴生成器生成液滴。乳化液滴被轉(zhuǎn)移到96孔ddPCR板中。標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增在C1000熱循環(huán)儀中進(jìn)行：95°C預(yù)變性10min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94°C 30s，58°C 1min），在98°C下進(jìn)行10min的酶失活步驟。溫度上升速率為每秒2°C。PCR擴(kuò)增后，使用QX200液滴讀取器和QX Manager 2.0軟件分析液滴。

通過QX Manager軟件確定了WPRE元件和參考基因TERT的拷貝數(shù)。假設(shè)每個(gè)二倍體細(xì)胞含有2個(gè)TERT基因拷貝，根據(jù)以下公式，將樣本的平均VCN（每細(xì)胞VCN，稱為VCNbulk）計(jì)算為靶向WPRE元件與參考TERT基因拷貝數(shù)的比值

6、檢測和定量WPRE的下限

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒編碼CAR和WPRE序列，用于確定WPRE的檢測和定量限。在每次ddPCR實(shí)驗(yàn)前，新鮮制備該質(zhì)粒的系列稀釋液（1:2）。使用dsDNA廣譜（BR）試劑盒與Qubit熒光計(jì)對未稀釋樣本的DNA濃度進(jìn)行定量。根據(jù)DNA分子量計(jì)算拷貝數(shù)，并進(jìn)一步計(jì)算系列稀釋樣本的拷貝數(shù)。將稀釋后的樣本（范圍從2500拷貝到1拷貝/mL）加入ddPCR反應(yīng)體系后，再通過ddPCR進(jìn)行分析。無模板對照（NTCs）用于確定空白限（LoB）。LoB、檢測下限（LLoD）和定量下限（LLoQ）通過以下公式計(jì)算：

7、基于ddPCR的VCN測定法的精密度和線性度

為驗(yàn)證所建立檢測方法區(qū)分信號與背景噪聲的能力，將兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品（CAR-1和CAR-2）的基因組DNA進(jìn)行系列稀釋，并等量摻入從與CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品相同供體的PBMC中分離得到的人基因組DNA。使用從非轉(zhuǎn)導(dǎo)PBMC中提取的基因組DNA樣品（不含WPRE元件）作為陰性對照。

8、細(xì)胞分選

9、精化計(jì)算

為根據(jù)基因修飾細(xì)胞的百分比對VCN進(jìn)行歸一化，使用以下公式計(jì)算調(diào)整后的VCN（VCNadj）

其中，VCNbulk 是通過 ddPCR 測定的批量 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品中的平均 VCN，而 1-e-VCNbulk 是根據(jù)泊松分布計(jì)算得出的理論轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

檢測特異性

引物和探針被設(shè)計(jì)為特異性靶向WPRE區(qū)域，該區(qū)域常用于提高病毒載體中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但不存在于人基因組中。首先，確認(rèn)了引物探針組合對實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的不同含有WPRE的CAR-T和TCR-T細(xì)胞產(chǎn)品的特異性。僅在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)品中檢測到WPRE陽性（FAM）液滴（藍(lán)/橙色點(diǎn)），而在未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照T細(xì)胞中未檢測到FAM陽性液滴。然而，TERT參考基因（HEX）在所有樣本中均有檢測到，除NTC外。此外，陽性與陰性液滴之間的明顯分離證明了該檢測的特異性。

WPRE定量檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度

由于缺乏已知拷貝數(shù)的WPRE參考材料，直接評估該檢測的準(zhǔn)確性變得頗具挑戰(zhàn)性。因此，選擇使用包含WPRE序列的質(zhì)粒來評估其準(zhǔn)確性。通過ddPCR，在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（每周一次）對雙倍連續(xù)稀釋的樣本進(jìn)行了三重復(fù)檢測，范圍從2500拷貝降至1拷貝/mL。如一維振幅圖所示，成功實(shí)現(xiàn)了陽性與陰性液滴之間的良好區(qū)分。對數(shù)-對佳擬合線顯示，預(yù)期的載體濃度（通過Qubit測量）與測得的載體濃度（ddPCR測量）之間具有良好的線性關(guān)系，平均R2值為0.9981（三次重復(fù)分別為0.9999、0.9945和0.9999）。這些結(jié)果表明，當(dāng)前設(shè)計(jì)在定量WPRE序列時(shí)能夠達(dá)到高特異性和準(zhǔn)確性。

在每次ddPCR運(yùn)行中，使用無核酸酶的水作為NTC，從而確定WPRE檢測的LoB為反應(yīng)混合物中的1.3拷貝/mL。隨后，計(jì)算出LLoD為反應(yīng)混合物中的2.3拷貝/mL，而LLoQ則設(shè)定為反應(yīng)混合物中的6.4拷貝/mL。

VCN定量與實(shí)驗(yàn)間重復(fù)性

通過使用含有WPRE序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，對來自兩名不同供體生成的CAR20-T細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行了檢測重復(fù)性和可再現(xiàn)性的評估，分別標(biāo)記為CAR-1和CAR-2。通過流式細(xì)胞術(shù)測量的CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品之間有所不同，其中CAR-1為52.3%，CAR-2為96.7%。每份樣本的基因組DNA被分離，并與固定量的非模板背景DNA（來源于與制備CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品相同供體的PBMCs中提取的人基因組DNA）進(jìn)行兩倍系列稀釋。加入基因組DNA是為了排除基質(zhì)干擾并模擬測試樣本中低拷貝數(shù)的情況。值得注意的是，所有稀釋樣本中的WPRE序列濃度值均超過了LLoQ（6.4拷貝/mL），這表明所有樣本孔的數(shù)值是可靠的。此外，在兩種CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中，測得的平均病毒拷貝數(shù)（VCNbulk）與預(yù)期轉(zhuǎn)導(dǎo)效率之間表現(xiàn)出強(qiáng)烈的線性關(guān)系（CAR-1的R2=0.9961，CAR-2的R2=0.9983）。這些數(shù)據(jù)證明了所建立的ddPCR檢測方法的準(zhǔn)確性，因?yàn)闃颖局蠧AR-T細(xì)胞基因組DNA的減少會(huì)導(dǎo)致平均VCN成比例下降。

為評估實(shí)驗(yàn)間重復(fù)性，稀釋后的樣本在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)、每周一次通過 ddPCR 進(jìn)行分析。所有測試均由同一位操作員使用相同的儀器完成。對不同時(shí)點(diǎn)測得的 VCN 進(jìn)行雙向方差分析，結(jié)果顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）。實(shí)驗(yàn)間的變異系數(shù)（CV%）始終小于 6%，表明該檢測方法具有很高的重復(fù)性。稀釋樣本的 VCNbulk 平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及 CV% 值見表 S2。這些結(jié)果證明了使用 ddPCR 測定攜帶同時(shí)編碼 WPRE 目標(biāo)序列的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品平均 VCN 的可行性，并且具有高度重復(fù)性。

轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VCN精確定量

該檢測方法的一個(gè)局限在于它依賴于包含轉(zhuǎn)導(dǎo)和未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的總體細(xì)胞群中的平均值。這在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品中尤其成問題，因?yàn)檗D(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VCN可能被低估。為了提高VCN作為臨床細(xì)胞產(chǎn)品安全指標(biāo)的可靠性和代表性，對轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的VCN進(jìn)行特異性定量至關(guān)重要。

嘗試根據(jù)泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)推算的理論轉(zhuǎn)導(dǎo)效率來調(diào)整總體VCN，這在實(shí)際轉(zhuǎn)導(dǎo)率未知時(shí)提供了佳估算。通過從6個(gè)CAR20-T細(xì)胞產(chǎn)品中分選出CAR陽性(CARpos)和CAR陰性(CARneg)細(xì)胞），評估了這種方法的可行性和準(zhǔn)確性，這些產(chǎn)品的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和平均VCN各不相同。在分析中，發(fā)現(xiàn)CARneg細(xì)胞群始終顯示出每細(xì)胞不足一份的VCN。這一結(jié)果與分選過程完全吻合，證實(shí)了這些細(xì)胞群中的低轉(zhuǎn)導(dǎo)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)狀態(tài)。相比之下，分選出的CARpos細(xì)胞表現(xiàn)出高于相同樣本總體平均VCN的VCN值（VCN CARpos對比VCNbulk），尤其是在總體VCN較低的情況下。例如，樣本S4的比較結(jié)果顯示VCN水平為0.57對比1.57，這表明僅依賴平均VCN無法準(zhǔn)確代表轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞群。

然而，調(diào)整后的VCN值（記為VCNadj）更能準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VCN，因?yàn)檫@些數(shù)值更接近VCN CARpos，尤其是在總體VCN較低的情況下。還估算了在每個(gè)給定VCN水平下的細(xì)胞百分比，并評估了VCN小于或等于某個(gè)給定值的細(xì)胞累積分布情況。結(jié)果表明，當(dāng)VCNadj升高時(shí)，相當(dāng)一部分細(xì)胞表現(xiàn)出更高的VCN水平。例如，在樣本S1和S3中，VCNadj分別為8.47和9，約一半的細(xì)胞VCN超過9。相反，在VCNadj較低（<5）的樣本中，超過90%的細(xì)胞VCN<5。

值得注意的是，計(jì)算得出的未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞（VCN為零）的理論百分比始終低于通過流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的數(shù)值，這表明某些細(xì)胞可能未達(dá)到可檢測水平的CAR表達(dá)，但仍含有病毒載體。這也與觀察結(jié)果一致，即即使在分選的CARneg細(xì)胞群中未檢測到CAR表達(dá)，仍能檢測到病毒載體的存在。

總之，研究結(jié)果強(qiáng)有力地支持了將VCNadj作為細(xì)胞產(chǎn)品可靠指標(biāo)的可行性，同時(shí)結(jié)合特定VCN水平的細(xì)胞比例及其累積分布進(jìn)行評估。這種全面的方法不僅提高了VCN報(bào)告的準(zhǔn)確性，還為CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的特性提供了更深入的認(rèn)識。

總結(jié)

qPCR是測定VCN的常用方法?；赿dPCR的技術(shù)已出現(xiàn)，提供了更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。此外，與基于qPCR的方法相比，ddPCR方法每反應(yīng)所需的輸入DNA更少（僅需20ng DNA）。在這里，建立并驗(yàn)證了一種用于測定CAR-T和TCR-T細(xì)胞產(chǎn)品中VCN的ddPCR方法。該方法旨在檢測常用于病毒載體設(shè)計(jì)中的WPRE序列，因此適用于病毒載體工程化CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的VCN定量分析。該方法表現(xiàn)出優(yōu)異的準(zhǔn)確性和靈敏度，在不同時(shí)間點(diǎn)的CV值低于6%，表明其具有高實(shí)驗(yàn)間精密度。因此，該方法適用于如CAR-T等臨床T細(xì)胞產(chǎn)品的VCN定量。

在臨床試驗(yàn)期間，監(jiān)測CAR-T細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)是另一個(gè)重要方面，因?yàn)镃AR-T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增和長期功能持續(xù)性與治療的療效和毒性相關(guān)。預(yù)計(jì)此檢測方法也可用于治療后患者體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的監(jiān)測，以追蹤藥代動(dòng)力學(xué)。然而，在此背景下應(yīng)用之前，需要進(jìn)行額外的驗(yàn)證工作。

這里，選擇使用一個(gè)預(yù)先建立的檢測方法來定量參考基因（TERT），而未進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)臨床背景的不同，TERT的拷貝數(shù)在癌細(xì)胞中可能會(huì)發(fā)生變化，在泛癌分析中約有2%的病例存在TERT擴(kuò)增。然而，認(rèn)為健康T細(xì)胞中TERT擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)較低，因?yàn)榈腃AR-/TCR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品會(huì)應(yīng)用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)以排除癌細(xì)胞。該方法專門用于定量γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體工程化細(xì)胞產(chǎn)品中的WPRE基因。理論上，此方法原理也可應(yīng)用于慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)品，以及缺乏WPRE基因插入的細(xì)胞產(chǎn)品。在后一種情況下，需要篩選和驗(yàn)證新的引物探針組合。

對整個(gè)測試細(xì)胞群體的平均值進(jìn)行VCN量化可能會(huì)低估轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際VCN。確定實(shí)際VCN的一種方法是對分選的CAR表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行分析。然而，這增加了復(fù)雜性和工作量。更重要的是，并非所有轉(zhuǎn)導(dǎo)（含病毒基因組）的細(xì)胞都能以可檢測和分選的水平表達(dá)CAR分子。為克服這些挑戰(zhàn)，建立了一種簡單的方法，通過用泊松統(tǒng)計(jì)計(jì)算的理論轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對VCNbulk進(jìn)行校正，從而近似轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的實(shí)際VCN。該計(jì)算也存在其自身的局限性，因?yàn)樗耆诟怕世碚撘约八袛?shù)學(xué)和生物學(xué)假設(shè)，包括（i）每次轉(zhuǎn)導(dǎo)都是隨機(jī)且獨(dú)立的；（ii）所有細(xì)胞對轉(zhuǎn)導(dǎo)的敏感性相同；（iii）無論是否發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)或插入拷貝數(shù)如何，所有細(xì)胞都以相似的速度生長。重要的是，由于在CARneg群體中也可能存在含病毒載體的細(xì)胞，因此也通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了VCN的調(diào)整優(yōu)化（VCNadj）在生物學(xué)上的合理性，因?yàn)閂CNadj值落在VCNbulk和VCN CARpos之間。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)分析，未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的平均VCN<1，證實(shí)這些細(xì)胞中幾乎沒有轉(zhuǎn)基因整合。

需要注意的是，該檢測方法評估的是群體水平的VCN，因此提供的是一個(gè)平均值，這意味著一定比例的細(xì)胞其VCN會(huì)高于平均值。有研究者研究了單細(xì)胞水平的VCN分布，并證明單細(xì)胞VCN的分布遵循群體VCN的平均值。然而，單細(xì)胞VCN分析流程需要更多的資源，且工作量更大，因此不太適合用于藥物產(chǎn)品上的常規(guī)測量。實(shí)際上，采用泊松統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，展示了在每個(gè)給定VCN下細(xì)胞的理論概率分布及其累積分布。這些信息與平均VCN值一樣重要，對于理解細(xì)胞產(chǎn)品內(nèi)部的整體VCN分布具有關(guān)鍵意義。

總之，在此介紹了一種快速且精確的VCN量化方法。通過對整體細(xì)胞群體進(jìn)行分析，并通過歸一化優(yōu)化數(shù)值（VCNadj），在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中，例如CAR-T細(xì)胞藥物產(chǎn)品中，這種方法在VCN的近似計(jì)算上既充分又具有成本效益，在準(zhǔn)確性和實(shí)用性之間找到了平衡。