GCGR激活下的肝臟脂肪代謝調(diào)控新機制

研究背景

代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病(me[x]tabolic Dysfunction Associated Steatotic Liver Disease, MASLD)的特征是肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度積聚，已成為慢性肝病和肝細胞癌的主要原因。胰高血糖素受體(Glucagon receptor, GCGR)激動劑是治療肝臟脂肪變性的一種有前途的治療選擇，而GCGR激活在治療MASLD中的潛在機制仍不清楚。本文發(fā)現(xiàn)四跨膜蛋白CD9可能介導(dǎo)GCGR激動劑的肝臟作用。CD9在MASLD患者的脂肪肝中表達減少，并在GCGR激活時上調(diào)。肝臟中CD9的缺乏通過調(diào)控補體因子D(Complement Factor D, CFD)介導(dǎo)的脂肪酸代謝，加劇飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性。因此，CD9可以調(diào)節(jié)GCGR信號對肝臟的有益作用，并可能成為治療肝臟脂肪變性的有希望的靶點。

技術(shù)路線

研究成果

1.CD9在患者和小鼠的脂肪肝中下調(diào)，并在GCGR激活后上調(diào)

為了篩選可能與GCGR激動劑對肝臟的影響相關(guān)的基因，作者分析了兩個公開的基因表達數(shù)據(jù)集。一個是注射了高選擇性GCGR激動劑的小鼠肝臟(GSE135881)，據(jù)報道該激動劑可改善肝臟脂肪變性。另一個是高脂肪飲食(High-Fat Diet, HFD)誘導(dǎo)的脂肪肝(GSE94754)，12個基因在GCGR激動劑治療和疾病模型之間表現(xiàn)出相反的表達變化，在GLP-1/GCGR激動劑(Cot)激活GCGR信號后，肝臟中的CD9和NOX4表達發(fā)生了變化，并且CD9的改變比NOX4更明顯。隨后研究了CD9參與GCGR信號對肝臟的影響的可能性。在MASLD患者的肝臟中觀察到mRNA和蛋白質(zhì)水平的CD9降低。與相應(yīng)的對照相比，小鼠模型（HFD、ob/ob和db/db）的肝臟中CD9表達持續(xù)下調(diào)。此外，在體內(nèi)和體外，Cot激活GCGR信號后，肝臟中CD9表達均上調(diào)。

2.肝臟中CD9缺失通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝加劇HFD下的肝臟脂肪變性

作者用含有肝細胞標志物甲狀腺素結(jié)合球蛋白(TBG)啟動子的重組腺相關(guān)病毒8載體(AAV8)敲低肝臟CD9（即AAV-shCD9）。AAV-shCD9治療導(dǎo)致小鼠肝臟中CD9特異性缺失，但不會在骨骼肌、脂肪組織、大腦或腎臟中缺失。觀察到AAV-shCD9小鼠和正常飲食(normal chow diet，NCD)下的AAV-shCtr小鼠的肝臟脂肪變性之間沒有差異，與HFD處理下的AAV-shCtr小鼠相比，AAV-shCD9小鼠的肝臟脂肪變性更為嚴重，體重、肝重和肝重/體重增加。還檢測到高表達的肝臟甘油三酯(TG)，組織學(xué)和油紅O染色進一步證實了AAV-shCD9小鼠肝細胞中脂質(zhì)積累明顯加劇。

此外，RNA測序(RNA-seq)和進一步的qPCR分析均表明，CD9缺乏主要增加脂肪酸合成基因，而不是與脂肪酸吸收和運輸相關(guān)的基因。脂肪酸合成基因增加和脂肪酸氧化基因減少進一步通過其在敲低CD9小鼠肝臟中的蛋白質(zhì)表達得到驗證。根據(jù)體內(nèi)實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染CD9小干擾RNA(siRNA)后，肝細胞內(nèi)TG含量和脂質(zhì)積累增加，而在游離脂肪酸處理下CD9過表達則減弱。此外，13C同位素測定評估體外脂肪生成和脂肪酸氧化進一步證實了CD9對脂肪生成和脂肪分解的調(diào)節(jié)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明CD9缺乏通過增強脂肪酸合成和抑制HFD下的氧化來加速肝臟脂肪變性。

3.CD9通過FLI1泛素化調(diào)控CFD通路來調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸代謝

研究通過分析CD9基因缺失時肝臟中差異表達的基因，探討了CD9對肝臟的影響?；駽FD的mRNA表達發(fā)生了變化。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CD9和CFD在MASLD進展過程中呈負相關(guān)。CFD的敲除抑制了CD9缺失誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性，而CFD的過表達導(dǎo)致了與CD9缺失相似的效果。這些發(fā)現(xiàn)表明，CD9缺失主要通過CFD誘導(dǎo)加速肝臟脂肪變性

研究調(diào)查了CD9如何在分子水平上調(diào)節(jié)CFD。體內(nèi)結(jié)果顯示，CD9操作會影響CFDmRNA水平，這表明CD9在基因轉(zhuǎn)錄本水平調(diào)節(jié)CFD。FLI1等轉(zhuǎn)錄因子對CFD的調(diào)控非常重要。瞬時轉(zhuǎn)染試驗和染色質(zhì)免疫沉淀試驗證實了FLI1與CFD之間的相互作用。FLI1的調(diào)節(jié)是CD9對肝細胞產(chǎn)生影響的原因。進一步的實驗表明，CD9通過翻譯后機制調(diào)節(jié)FLI1蛋白的穩(wěn)定性。FLI1與野生型HA-泛素或缺乏K48和K63鏈的泛素突變體共表達顯示，CD9過表達會減少FLI1的泛素化，而K48R和K63R突變體則會消除泛素化。將突變體FLI1(K344R)與HA泛素共表達顯示，CD9的過量表達抑制了FLI1的泛素化，而K344R突變體的抑制作用減弱。這表明FLI1蛋白的K344殘基可能是CD9調(diào)控FLI1泛素化的關(guān)鍵位點。通過共沉淀實驗還發(fā)現(xiàn)了CD9與FLI1的相互作用。作者將CD9與質(zhì)膜標記物鈉鉀ATP酶共染色。結(jié)果顯示，CD9的亞細胞定位在質(zhì)膜上。CD9與FLI1的共染顯示了它們的共定位。表明CD9-FLI1的相互作用是在質(zhì)膜附近。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CD9通過FLI1的泛素化-蛋白酶體降解來調(diào)節(jié)CFD。

4.CD9通過CFD調(diào)節(jié)脂肪組織的脂肪生成和燃燒來影響體重

在肝臟中敲低CD9會導(dǎo)致體重變化，脂肪組織的重量增加，脂肪細胞體積增大。間接熱量測定法研究顯示，CD9影響能量消耗，但不影響食物攝入或體力活動。在CD9基因缺陷小鼠的脂肪組織中觀察到產(chǎn)熱基因減少和脂肪生成基因增加。CD9缺陷小鼠的血清誘導(dǎo)脂肪細胞中的脂肪生成基因，這可能是通過循環(huán)因子CFD實現(xiàn)的。CD9缺陷小鼠體內(nèi)的CFD水平升高，其受體C5aR在調(diào)節(jié)脂肪細胞功能方面發(fā)揮了作用。

5.過表達肝臟中的CD9可減輕肝臟脂肪變性

接下來，作者評估了在HFD小鼠中挽救肝臟CD9表達的效果。AAV8-TBG-CD9過表達肝臟CD9降低了體重、肝重和肝重/體重，并改善了肝臟TG、脂質(zhì)積累以及相關(guān)的脂質(zhì)基因和蛋白質(zhì)表達。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的肝酶活性降低，表明AAV-CD9也改善了肝功能。此外，CD9強化降低了CFD并增加了FLI1蛋白水平，這與前面提到的機制觀察結(jié)果一致。這些發(fā)現(xiàn)表明CD9過表達可減輕MASLD的發(fā)展。

6.CD9促進GCGR激活對肝臟的益處

為了確定CD9是否參與了GCGR激動劑對肝臟的影響。作者使用了GCGR/GLP1R雙激動劑Cot，因為已經(jīng)證明肝臟作用主要通過GCGR實現(xiàn)，而肝外改善則通過GLP1R實現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cot緩解了肝臟脂肪變性，表現(xiàn)為體重、肝重和肝重/體重比、肝臟TG含量和形態(tài)的降低，以及脂肪酸合成和氧化基因和蛋白質(zhì)的改變，用AAV-TBG-shCD9降低肝臟CD9可消除Cot治療對脂肪變性和脂質(zhì)蓄積的緩解，體重除外，這些結(jié)果表明Cot對肝臟有益是通過CD9引起的GCGR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實現(xiàn)。而不是GLP1R引起的肝外體重改善。

研究結(jié)論

本文篩選了四跨膜蛋白CD9可能調(diào)節(jié)GCGR激動劑的肝臟作用。CD9在MASLD患者的脂肪肝中減少，并在GCGR激活時上調(diào)。作者發(fā)現(xiàn)CD9通過泛素化-蛋白酶體降解FLI1來調(diào)節(jié)CFD表達，從而調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸合成和氧化基因。CD9通過CFD調(diào)節(jié)脂肪組織的脂肪生成和產(chǎn)熱，從而影響體重，減輕肝脂肪變性。因此，CD9可以調(diào)節(jié)GCGR信號對肝臟的有益作用，并可能成為治療肝臟脂肪變性的有希望的靶點。